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背景
原发性硬化性胆管炎(PSC)是一种罕见的胆管淤积性肝病，其特征为肝内和肝外胆管慢性炎症和进行性纤维化。肝脏恶性肿瘤，主要是胆管癌的风险增加。遗传、环境和免疫风险因素、肠道微生物群和肝-肠轴失调、胆管成分和胆管上皮细胞(BEC)表型的变化都与PSC的病因有关。目前，尚未批准用于PSC的药物治疗。
研究亮点
1、TGR5在PSC和Abcb4-/-肝的胆管细胞中以细胞类型特异性方式下调。
2、白介素-8降低胆管上皮细胞和胆管器官样细胞中的TGR5水平。
3、Tgr5缺陷小鼠的胆管损伤加重，而过量表达Tgr5的Abcb4-/-小鼠的胆管损伤减弱。
4、ScRNA-seq显示，在Abcb4-/-小鼠中过量表达Tgr5可改善活化的炎症性胆管表型。
5、norUDCA治疗恢复了Abcb4-/-小鼠的胆管中Tgr5的表达。
简介
年4月16日，来自德国海因里希·海涅大学医学院的VerenaKeitel及其团队在JHepatol(IF:20.)杂志上发表名为DownregulationofTGR5(GPBAR1)inbiliaryepithelialcellscontributestothepathogenesisofsclerosingcholangitis的研究[1]。
主要结果
PSC肝脏BECs中TGR5荧光强度降低
在用抗TGR5和细胞角蛋白-7(CK-7)抗体染色的对照肝的BECs中，在顶膜内或顶膜附近检测到高TGR5蛋白表达(图1A)。在PSC肝脏中，TGR5染色也存在于BECs中，其亚细胞分布与对照组相似(图1A)。然而，与CK-7FI相关的TGR5荧光染色强度(FI)在设定为%的对照组中降至60.6±6.1%(图1B)。在所有分析的肝脏中，CK-7FI具有可比性。在早期和晚期PSC组织中均检测到TGR5BECFI降低，这表明TGR5蛋白水平在疾病进程早期下降，并在疾病进展期间保持在较低水平。为了探讨BECs中TGR5FI下调是否是肝病中的常见现象，在原发性胆管炎(PBC)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、药物性肝损伤(DILI)和慢性病毒性肝炎患者的肝脏中测定了TGR5BECFI(图1C)。在这些疾病的肝组织中未观察到TGR5BECFI降低(图1D)，表明存在疾病相关/特异性的下调。
图1.PSC肝活检BECs中TGR5荧光强度降低
Abcb4-/-小鼠肝内外管中Tgr5表达水平降低
为了确定是否在肝内和肝外导管的BECs中发现Tgr5下调，使用Abcb4-/-小鼠作为硬化性胆管炎模型。EpCAM+/CD30-/CD45-/CD11b-BECs通过6-8周龄野生型(wt)和Abcb4-/-小鼠肝脏中的FACS富集。与wt细胞相比，来源于Abcb4-/-动物的EpCAM+细胞中的相对Tgr5mRNA水平降低至43.9±0.7%(图2A)。相反，在Abcb4-/-小鼠的EpCAMnon实质细胞中，Tgr5mRNA的表达没有改变。显微解剖的肝内小叶导管或肝外小叶管进行的分析显示，与wt同窝幼鼠相比，Abcb4-/-动物中的Tgr5mRNA水平分别显著降低约40%和50%(图2B，C)。
图2.在Abcb4-/-小鼠的胆管树中Tgr5水平降低
白细胞介素-8(CXCL-8)及其鼠同源物可抑制鼠和人胆管细胞中的TGR5水平
衰老增加已被确定为PSC的标志，来自PSC肝脏的胆管细胞表达并分泌炎性细胞因子和趋化因子，如白细胞介素-6(IL6)、白细胞介素-8(IL8、CXCL8)和CC-趋化因子配体-2(CCL2)，它们是衰老相关分泌表型的标志。PSC患者胆管和血清中高水平的IL8与疾病进展和无移植物存活率降低相关。因此，我们检测了6-8周龄Abcb4-/-小鼠血清中的Il8同源物、Il6和Ccl2是否升高。事实上，与wt同窝幼鼠相比，Abcb4-/-小鼠中KC/Cxcl1、Mip2/Cxcl2、Il6、Ccl4和Ccl2的血清水平升高了1.8、1.2、2.5、1.4和1.7倍(图3A)。
图3.用IL8及其同源物治疗小鼠和人BECs可触发TGR5mRNA和蛋白水平降低
Tgr5水平的降低与BECs中Tgr5信号通路的降低有关，容易导致更严重的胆管损伤
为了研究Tgr5下调是否影响Tgr5依赖性信号传导，从wt和Abcb4-/-肝脏中分离的BECs进行了Erk1/2磷酸化和Erk1/2总量的蛋白质印迹法。随着Tgr5蛋白水平的降低，来自Abcb4-/-肝的BECs中Erk1/2磷酸化水平降低(图4A)。全肝样本分析结果相同(图4B)。由于本研究中BECs中的Tgr5水平降低了约40-60%，因此我们研究了仅在一个等位基因上缺失Tgr5是否足以使小鼠在LCA喂养后更易受到胆管损伤。在84小时内向Wt、Tgr5+/-和Tgr5-/-小鼠喂食LCA，导致所有基因型的严重肝损伤。胆管表型分析显示，杂合子Tgr5+/-动物的血清ALP水平显著升高，组织学上硬化性胆管炎表型加重。
图4.Abcb4-/-小鼠的胆管细胞和肝组织中Erk1/2磷酸化降低
单细胞RNA测序显示Abcb4-/-小鼠的肝内胆管细胞具有活化的炎症表型
通过FACS从肝细胞裂解物中分离EpCAM+-BECs，然后使用10xGenomics进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析。过滤后，8只肝脏总计40.个细胞用于进一步分析。聚类的UMAP投影显示9个聚类，使用已知谱系标记将其分配到细胞类型(图5A)。该项目的测序数据可在GEO上查阅。BECs以EpCAM、Sox9、Spp1、Krt7(Ck-7)、Krt19(Ck-19)、Tm4sf4和Clu表达为特征。随着导管反应的增加，从Abcb4-/-肝中衍生出了大量EpCAM+-BECs(图5B)。虽然在BECs中检测到Tgr5，但Tgr5的表达水平较低，这与既往研究结果一致，因此没有根据Tgr5的表达水平进行聚类。对比wt和Abcb4-/-BECs，显示出先前与活化的炎症BECs表型相关的基因显著上调，如细胞间粘附分子-1(Icam1)、血管细胞粘附分子(Vcam1)、Ccl2和Tgf-2(图5C)。wt和Abcb4-/-BECs之间有个基因受到差异调控(图5D)。通路分析显示，在Abcb4-/-BECs中，NFκB、Tlr2、Il6和Il17A信号通路被激活(图5E)。
图5.单细胞RNA-seq分析显示Abcb4-/-小鼠存在炎症反应性BEC表型
NorUDCA恢复了Abcb4-/-小鼠BECs中的Tgr5水平
NorUDCA已被证明可改善Abcb4-/-小鼠的硬化性胆管炎表型，并降低PSC患者的ALP血清水平。因此，我们分析了用norUDCA或UDCA喂养4周的Abcb4-/-小鼠的肝脏中的Tgr5FI。与未治疗的小鼠相比，用正常UDCA喂养的Abcb4-/-动物的BECs中的Tgr5FI增加了3.2倍，因此恢复到与wt动物相当的水平(图8A，B)。UDCA喂养导致Tgr5mRNA水平显著升高，但仅部分恢复了Tgr5FI与wt水平的关系。在Cxcl1预培养24小时的小鼠BECs中加入norUDCA或UDCA24小时，可恢复Cxcl1诱导的Tgr5mRNA水平的下调(图8C)。同样，norUDCA恢复了IL8诱导的人胆管源性器官样物质中TGR5mRNA水平的下调(图8D)。
Fig.8.NorUDCA恢复Abcb4-/-动物BECs中的Tgr5FI
结论及展望
慢性炎症、胆汁淤积和纤维化是PSC的特征。该疾病的初始诱因仍然未知，且不同患者群体之间可能存在差异。据推测，在遗传易感个体中，胆管上皮暴露于病原体或微生物来源的产物可能触发活化的促炎BEC表型的发生，这在PSC和Abcb4-/-动物中均有发现。
总之，在PSC和Abcb4缺陷小鼠中观察到的胆管性TGR5表达下调有助于炎症反应性BEC表型的发展。这可在Abcb4-/-小鼠中通过Tgr5的过表达或通过norUDCA恢复Tgr5水平而减弱。TGR5表达的保持和上调可能是迄今为止尚未描述的norUDCA活性机制，因此TGR5水平的上调可能被证明对PSC有益。
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